Mikroskopija

Mikroskopska se pretraga može izvesti brzo, no točnost ovisi o iskustvu mikroskopičara i kvaliteti opreme. Propisi često ograničavaju liječnicima korištenje mikroskopa u dijagnostičke svrhe izvan ovlaštenog laboratorija.

Većina uzoraka se oboji bojom koja oboji uzročnika, čime se oni razlikuju od pozadine, premda se za otkrivanje gljivica, parazita (uključujući jajašca i larve helminta), vaginalnih “grudica” stanica i pokretnih uzročnika (npr. Trichomonasa) rabe neobojeni vlažni razmazi. Kako bi se gljivice bolje raspoznale, razmazu se može dodati 10%–tni kalijev hidroksid (KOH) koji otapa okolno tkivo i mikroorganizme. Kod mikroskopije u tamnom polju u svrhu otkrivanja sifilisa također se rabe neobojeni razmazi.

Kliničar traži bojenje na osnovi najvjerojatnijeg uzročnika, mada niti jedna boja nije 100% specifična. Većina uzoraka se boji po Gramu, te, ako se sumnja na mikobakterije, acidorezistentnom bojom (po Ziehl–Nielsenu, op.prev.). Međutim, pri ovom bojenju neki uzročnici se ne prikazuju lako; ako se na njih sumnja, potrebno je primijeniti druge boje ili druge načine otkrivanja. Budući da je za mikroskopsko otkrivanje obično potrebna koncentracija mikroorganizama od ~1 × 105/ml, prije pretrage se većina tjelesnih tekućina (npr. likvor, mokraća) koncentrira (npr. centrifugiranjem).

Bojenje po Gramu: Bojenjem po Gramu se bakterije razlikuju po tome da li primaju kristal violet (Gram pozitivne—plave boje), po svojoj morfologiji (npr. bacili ili koki) i načinu rasta (npr. u nizovima, nakupinama, diploidima). Prema tim osobinama se može odrediti antibiotsko liječenje, sve dok se ne dobije konačni rezultat. Za izvođenje bojenja po Gramu, uzorak se toplinom fiksira na predmetnicu i boja izlaganjem nizu Gramovog kristal violeta, lugola, sredstva za odbojavanje i suprotne boje (tipično safranina).

Bojenje i modificirano bojenje

acidorezistentnih uzročnika: Ove se boje rabe za otkrivanje acidorezistentnih organizama (Mycobacterium sp.) i umjereno acidorezistentnih organizama (ponajprije Nocardia sp.). Također su korisne za bojenje Rhodococcusa i srodnih vrsta, kao i oocista nekih parazita (npr. Cryptosporidiuma).

Premda je za otkrivanje mikobakterija u sputumu potrebno samo ~5000–10.000 organizama/ml, mikobakterije se često nalaze u manjoj količini, tako da je osjetljivost metode ograničena. Specifičnost je bolja, premda je neke umjereno acidorezistentne organizme teško razlikovati od mikobakterija.

Fluorescentna bojenja: Ona omogućuju otkrivanje manjih koncentracija (1 × 104 stanica/ml). U primjere spadaju akridin oranž (bakterije i gljivice), auramin–rodamin i auramin O (mikobakterije) i kalkofluor (fluorokrom) bijela boja (da gljivice, osobito dermatofiti postanu fluorescentni pod ultraljubičastim svjetlom mikroskopa).

Spajanje fluorescentne boje s protutijelom za uzročnika (direktna ili indirektna imunofluorescencija) teoretski bi trebalo povećati osjetljivost i specifičnost. Međutim, ove je testove teško očitati i protumačiti, a malo ih je dostupno na tržištu i u svakodnevnoj upotrebi (npr. direktni test imunofluorescencije na Pneumocystis i Legionellu).

Bojenje indijskim modrilom (koloidni ugljen): Ova se boja koristi uglavnom za otkrivanje Cryptococcus neoformansa i drugih inkapsuliranih gljivica u suspenziji stanica (npr. sedimentu likvora). Zapravo se više od uzročnika oboji pozadina, što čini vidljivom kapsulu oko uzročnika u vidu prosvjetljenja (haloa). Kod pretrage likvora, bojenje nije tako osjetljivo kao otkrivanje antikriptokoknog antigena. I specifičnost je ograničena jer se leukociti mogu doimati inkapsuliranima.

Bojenje po Wrightu i Giemsi: Ova se bojenja rabe za otkrivanje parazita u krvi, Histoplasme capsulatum u fagocitima i stanicama tkiva, unutarstaničnih inkluzija virusa i klamidija, trofozoita Pneumocystis jiroveci (prije P. carinii), i nekih intracelularnih bakterija.

Trikromno bojenje (po Gomori– Wheatleyu) i hematoksilin–željezo bojenje: Ova se bojenja rabe za otkrivanje crijevnih protozoa. Bojenje po Gomori– Wheatleyu se rabi za otkrivanje mikrosporidija. Bojenje hematoksilin–željezom različito oboji stanice, stanične inkluzije i jezgre. Bojenjem po Gomori–Wheatleyu se može previdjeti jajašca i larve helminta, a nije pouzdano ni otkrivanje Cryptosporidiuma. Boju primaju i gljivice i stanice ljudskog tkiva. Bojenjem hematoksilin–željezom jajašca helminta se mogu obojiti pretamno što onemogućuje otkrivanje.